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              核黃素(維生素B2)熒光光度定量測定法

              發布時間: 2022-04-07  點擊次數: 275次

               一、目的

                     1.了解熒光法測定核黃素的原理和方法

                     2.學習熒光光度計的操作和使用

                     3.掌握熒光定量分析工作曲線

              二、原理

                     核黃素(維生素B2)是一種異咯嗪衍生物,其水及乙醇的中性溶液為黃色,并且有很強的熒光,這種熒光在強酸和強堿中易被破壞。核黃素可被亞硫酸鹽還原成無色的二氫化物,同時失去熒光,因而樣品的熒光背景可以被測定。二氫化物在空氣中易重新氧化,恢復其熒光,

              三、實驗器材

                     1.核黃素片(5mg/片)

                     2.熒光光度計

                     3.容量瓶100ml(*2)

                     4.試管1.5cm*15cm(*7)

                     5.吸管10.0ml(*1),5.0ml(*1),2.0ml(*1),0.50ml(*2)

                     6.量筒1000ml(*1),100ml(*1)

              四、實驗試劑

                     1.核黃素標準溶液:準確稱取核黃素10mg,放入預先裝有約50ml蒸餾水的1000ml容量瓶中,加入 5ml 6mol/ L 乙酸,再加入大約800ml水,置水浴中避光加熱直至溶解,冷卻至室溫,用蒸餾水定容至1000ml,混勻。

                     2.連二亞硫酸鈉(保險粉)或亞硫酸鈉。

                     3.  36%乙酸。

              五、操作

                  1.標準曲線繪制

                     將配好的10ug/ ml 標準核黃素溶液,按表50所示比例稀釋成六個標準溶液。

                  2.樣品溶液的配制

                     將被測的樣品(如核黃素藥片、維生素 B 針劑等)參照標準溶液的含量范圍和溶劑體系配制成測定溶液。對于食物和生物材料中的核黃素測定,一定需要事先經過抽提,或經過分離,純化處理。

                  3.熒光測定

                     參照附錄六中熒光光度計的使用說明,選用濾色片,核黃素熒光測定的激發光波長為460nm,發射光波長為520nm。因此可選用帶迪型400nm(藍色)濾色片為激發光濾色片,選用截止型510nm(紅色)濾色片為發射光濾色片。待儀器預熱并調好零點后,用0號標準溶液(2.5ug/ ml )作為參比溶液調熒光光度計的熒光強度讀數到滿刻度(100%),分別測定其他標準溶液和樣品溶液的相對熒光強度,在測定中如果樣品溶液的熒光強度超出100%則需要再行稀釋,在每一個測定溶液測定完后,需要重新倒回到相應的試管內。

                  4,  數據處理

                     每一個測定溶液的熒光強度讀數矯正公式為:F=F1+F2

                     式中 F:校正后的熒光強度;

                             F1:未還原時測得的熒光強度:

                             F2:還原后測得的熒光強度。

                     以標準溶液校正后的熒光強度為縱坐標,相應的含量為橫坐標,作出核黃素測定的標準曲線。將樣品溶液校正后的熒光強度在工作曲線上查出相應的含量。

              六、注意事項

                     在所有操作過程中,要避免核黃素受陽光直接照射。


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