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              四種蛋白含量測定方法比較

              發布時間: 2022-06-24  點擊次數: 80次

              蛋白質是一切活細胞和有機體的最重要和最必需的組成成分,它是構成人體及所有動物機體組織干物質的主要部分。例如,人體按總量計算,干重54%是蛋白質,即除去水分后,蛋白質約占體重的一半左右,可見蛋白質是生命活動中最重要的物質基礎。

                     蛋白質是由二十種氨基酸以肽鍵相互聯接而成的復雜的高分子化合物,它水解的最終產物是氨基酸。在蛋白質分子內又通過氫鍵、鹽鍵、疏水作用力構成蛋白質的空間結構,即蛋白質的構象( conformation )。當蛋白質分子受到某些物理、化學因素影響時,它的空間結構就會發生改變或破壞,物理化學性質和生物學性質也隨著發生變化,稱為蛋白質的變性作用。因此在研究蛋白質的生物學功能時,應防止它的變性作用。

                     蛋白質在溶液中的分子大小,溶解度,電荷,吸附性質和對其他分子的親和力等各不相同,根據這些因素,可以選擇一定的方法分離,制備和鑒定蛋白質。利用蛋白質肽鏈末端基的特點,還可以設計特殊的分析技術來測定蛋白質的一級結構。

                     氨基酸是構成蛋白質的基本單位,它也是生物體維持生長所必需的營養物質,具有特殊的生理作用,參與生物機體的代謝。因此對氨基酸的分離測定在實際工作中也是重要的。

                     蛋白質含量可從它們的物理化學性質,如折射率、比重,紫外吸收、染色等測定而得知;或用化學方法,如定氮、雙縮脲反應、 folin﹣酚試劑反應、BCA法等方法來測定。其中 Folin ﹣酚試劑法和考馬斯亮藍染色法是一般實驗室中經常使用的方法。而 Folin﹣酚試劑法靈敏度較高,較紫外吸收法靈敏10~20倍,而較雙縮脲法靈敏100倍左右。這類方法操作簡便、迅速,不需要復雜和昂貴的設備,又能適合一般實驗室的要求,若作一般測定較為適宜。

                     一、雙縮脲法

                        1.原理

                       在堿性溶液中蛋白質與Cu2+形成紫紅色絡合物,其顏色的深淺與蛋白質的含量成正比,而與蛋白質的相對分子質量及氨基酸成分無關,故可用來測定蛋白質含量。測定范圍1~10mg蛋白質。

                       雙縮脲法于需要快速但并不需要十分精確的測定。硫酸銨不干擾此呈色反應,使其有利于對蛋白質純化早期步驟的測定。

                       干擾此測定的物質包括在性質上是氨基酸或肽的緩沖劑,例如 Tris 緩沖液,因為它們給予陽性呈色反應。Cu2+也容易被還原,有時發現出現紅色沉淀。

                       2.器材

                      蛋白的提?。筛鶕A實驗結果適當調整樣本量及比例) ①組織:按照組織質量(g):提取液體積(mL)為 1:(5-10)的比例(建議稱取 0.1 g 組織,加 入 1 mL 提取液)處理樣品,冰浴勻漿,4℃ 10000 rpm 離心 10 min,取上清置于冰上待測。 ②細菌或細胞:離心收集細菌或細胞到離心管內,按照細菌或細胞數量(104 個):提取液體積(mL) 為(500-1000):1 的比例(建議 500 萬細菌或細胞加入 1 mL 提取液)處理樣品,冰浴超聲破碎(功 率 300 W,超聲 3 s,間隔 7 s,總時間 3 min),4℃ 10000 rpm 離心 10 min,取上清置于冰上待測。 ③液體樣本:澄清無色液體樣品可以直接或使用提取液適當稀釋后再進行測定。

                     測定過程中所需要的儀器和試劑:可見分光光度計、1 mL 玻璃比色皿、研缽/勻漿器、可調式移 液器、臺式離心機和蒸餾水。

                     3.注意事項

                       待測樣本蛋白濃度須在 0.5-10 mg/mL 范圍內,正式測定應取 1-2 個差異樣本進行預實驗,確保 蛋白濃度在此范圍內,低于 0.5 mg/mL 則不能使用此法測定,高于 10 mg/mL 或吸光值大于 0.4 應使用 Extract Solution 適當稀釋后再進行測定,計算時相應修改。

                     二、Folin﹣酚試劑法(Lowry法)

                     1.原理

                     用于蛋白質測定的 Lowry 反應是雙縮脲方法的發展,Lowry 蛋白含量檢測法是通過蛋白質與銅離子在堿性條件下生成蛋白質-銅絡合物,進一步將 Folin 試劑還原生成深藍色化合物,產物在 650 nm 處具有特征吸收峰,通過吸收值的變化即可定量檢 測樣品蛋白濃度。

                     這個測定法較雙縮脲法靈敏得多。對雙縮脲反應發生干擾的離子同樣容易干擾Lowry反應,而且對后者的影響還要大得多。所測蛋白質樣品中若含酚類及檸檬酸均有干擾作用。濃度較低的尿素(約0.5%左右)、胍(0.5%左右)、硫酸鈉(1%)、硝酸鈉(1%)、三氯乙的酸(0.5%)、乙的醇(5%)、(5%)、丙酮(0.5%)等溶液對顯色無影響,這些物質濃度高時必須做校正曲線。此法也適用于酪氨酸和色氨酸的定量測定。

                     2.器材

                     分光光度計    恒溫水浴

                     3.檢測方法優勢

                     ①移液器移取少量液體時的誤差,會對標準曲線低濃度點造成影響,樣品點應落在標準線 1/2 后;

                     ②BSA Standard Solution 4℃保存有效期 3 個月,-20℃保存有效期一年,其他試劑室溫保存有效 期一年,試劑開封使用后請及時密閉保存;

                     ③Lowry 法定量范圍為 50-500 µg/mL,Folin 試劑顯色反應由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起, 樣品若含有酚類、檸檬酸和巰基化合物均有干擾作用,不同蛋白質因酪氨酸、色氨酸含量不同而使 顯色強度稍有不同;

                     三、考馬斯亮藍染色法(Bradford法)

                     1.原理

                     1976年 Bradford 建立了用考馬斯亮藍 G -250與蛋白質結合的原理,迅速、敏感的定量測定蛋白質的方法。染料與蛋白質結合后引起染料最大吸收的改變,從465nm變為595nm,光吸收增加。蛋白質﹣染料復合物具有高的消光系數,因此大大提高了蛋白質測定的靈敏度,最大低檢出量為1ug蛋白。染料與蛋白質的結合是很迅速的過程,大約只需2分鐘,結合物的顏色在1小時內是穩定的。一些陽離子,如 K+ , Na+, Mg2+ ,( NH4)2SO4,乙的醇等物質不干擾測定,而大量的去污劑如 TritonX -100, SDS 等嚴重干擾測定,少量的去污劑可通過用適當的對照而消除。以下試劑對考馬斯亮藍 G -250-蛋白質復合物有影響:1mol/LKCL、5mol/NaCL、1mol/LMgCL2、2mol/LTris、0.1mol/LEDTA、1mol/L(NH4)2SO4、99%乙的醇、5%酚、丙酮、0.1%TritonX-100、1%TritonX-100、0.1%SDS、1%SDS。由于染色法簡單迅速,靈敏度高,現已廣泛應用于蛋白質含量的測定。

                     2.器材

                     分光光度計     微量注射器

                     檢測方法優勢

                     Bradford 法測定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的化學物質的影響,樣品中巰基乙的醇的濃度可 高達 1 M,二硫蘇糖醇的濃度可高達 5 mM;但受略高濃度的去垢劑影響,需確保樣品中 SDS 濃度低 于 0.1%,TritonX-100 低于 0.1%,Tween 20、60、80 低于 0.06%;

                     四、BCA法

                     1.產品描述

                     BCA(Bicinchonininc Acid)蛋白含量檢測法是用于總蛋白質定量的常用方法,BCA 與二價銅離 子混合即為 BCA 工作液,蛋白在堿性條件下能夠將 Cu2+還原為 Cu+,Cu+與 BCA 試劑可形成紫色絡 合物,產物在 562 nm 處具有特征吸收峰,通過吸光值變化即可定量檢測樣品的蛋白濃度。

                     2.注意事項

                     ①Copper Solution 與 PBS Diluent 可置于 2-8℃長期保存,若發現污染渾濁則應丟棄;BCA Solution 在低溫條件下出現結晶沉淀時,可 37℃溫育使其完全溶解,不影響使用;

                     ②為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作;

                     檢測方法優勢

                     ③BCA 法測定蛋白含量不受絕大部分樣品中化學物質的影響,樣品中 5% SDS、5% Triton X-100、 5% Tween20、60、80 等常用濃度去垢劑不影響檢測結果,但 EDTA 和 EGTA 等螯合劑、DTT 和巰基 乙的醇等還原劑和脂類會影響檢測結果,需確保 EDTA 低于 10 mM、無 EGTA、二硫蘇糖醇低于 1 mM、 巰基乙的醇低于 0.01%;若樣品含有較多干擾物質且本身背景值較高,建議使用 Bradford 法蛋白含量檢測試劑盒(Cat AKPR015);

                     ④若蛋白濃度較低時(小于 50 μg/mL),可將顯色溫度提高至 60℃且待測樣本

              與工作液比例調整 為 1:8 進行測定,能夠明顯提高靈敏度至 5 μg/mL;

                     ⑤為保證結果準確且避免試劑損失,測定前請仔細閱讀說明書(以實際收到說明書內容為準), 確認試劑儲存和準備是否充分,操作步驟是否清楚,且務必取 2-3個預期差異較大的樣本進行預測定,過程中問題請您及時與工作人員聯系。


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